Conservazione ex situ

La strategia di conservazione ex situ, attuata in diverse parti del mondo, mediante la costituzione di banche del germoplasma, rappresenta una forma avanzata di tutela delle risorse genetiche, una sorta di assicurazione e di garanzia per il futuro.

La Conservazione in Umbria

Diverse e molteplici sono in tal senso le raccomandazioni di Organizzazioni Internazionali, Enti ed Istituti di ricerca circa le migliori strategie e metodiche da adottare per garantire una efficace ed efficiente conservazione nel tempo delle risorse genetiche.

Le metodologie messe in atto in Umbria per conservare in sicurezza le diverse risorse genetiche interessano non solo specie vegetali e animali, ma includono anche i microrganismi utili ai processi di trasformazione dei prodotti agroalimentari.

Le Banche del Germoplasma consentono la conservazione di semi, propaguli, cellule delle entità biologiche di interesse (varietà, razze, ceppi) in condizioni ambientali controllate. Le risorse così conservate mantengono le proprie capacità vitali per un tempo relativamente lungo (in funzione della specie e del tipo di conservazione). Si tratta di fatto di un tipo di conservazione statica, che “congela” le informazioni genetiche presenti nel campione conservato, e che, a differenza della conservazione in situ, non permette che la risorsa coevolva con l’ambiente circostante. D’altra parte, questo tipo di conservazione ha il vantaggio di salvaguardare le risorse al riparo da epidemie o gravi avversità ambientali, preservandole di fatto dall’estinzione. La conservazione ex situ di germoplasma animale richiede particolari risorse tecnologiche e finanziarie, ed è per questo svolta solo in casi estremi. A questo proposito, il Piano Nazionale sulla Biodiversità di interesse Agricolo (PNBA) si propone di individuare due centri nazionali di riferimento per la conservazione del germoplasma dei tipi genetici autoctoni presenti in Italia.

Per varietà vegetali arboree la conservazione ex situ può essere svolta anche in vivo, tramite l’impianto di campi collezione. L’impianto di campi collezione di varietà erbacee, soprattutto se annuali, può invece avere interesse solo a scopo dimostrativo-didattico, vista l’assenza di garanzie sulla durata della collezione.

Nelle sottosezioni seguenti trovate la descrizione delle diverse banche del germoplasma regionali e dei campi collezione regionali di varietà arboree da frutto.

Il caso della Regione Umbria è forse particolarmente emblematico, in quanto dispone di ben 5 diversi strumenti creati per assicurare tale conservazione, che spaziano dalle risorse vegetali a quelle animali fino ad includere i microrganismi utili ai processi di trasformazione dei prodotti agroalimentari.

Banca del Germoplasma in vitro

La Banca del Germoplasma in vitro è stata realizzata nel corso del progetto “La Valorizzazione della Biodiversità vegetale in Umbria e la sua Conservazione” a partire dal 2002. Ospitata presso il laboratorio di colture in vitro di 3A-PTA, conserva una parte della collezione di varietà locali da frutto ritrovate nel corso degli anni nel territorio regionale.

La coltura in vitro è una tecnica che consente la moltiplicazione di specie vegetali in condizioni di luce e temperatura controllate, mediante l’utilizzo di camere climatiche. Presenta numerosi vantaggi tra i quali: concentrare in spazi ridotti numerose accessioni, destagionalizzare le attività di propagazione, possibilità di effettuare trattamenti di risanamento da virus e batteriosi di esemplari infetti attraverso tecniche di termo e crio-terapia.

La conservazione in vitro nel caso di risorse genetiche a rischio di estinzione è particolarmente importante, perché permette di salvaguardare in condizioni di sterilità genotipi che sono presenti sul territorio in pochissimi esemplari, spesso vecchi e malati, e quindi a forte rischio di scomparsa a seguito di epidemie o cambiamenti climatici.

Attualmente la collezione raccoglie 59 accessioni (ognuna corrispondente ad una varietà) così ripartite:

  • Melo, 19
  • Pero, 9
  • Prugno, 11
  • Pesco, 4
  • Ciliegio, 2
  • Fico, 6
  • Vite, 6
  • Ortive, 2

METODOLOGIA DI LAVORO

La coltura in vitro offre il vantaggio di poter raccogliere in uno spazio esiguo molti genotipi diversi, oltre alla possibilità di attuare una moltiplicazione massale in tempi relativamente ridotti. Altri aspetti che rendono vantaggioso il ricorso a questa particolare tecnica sono la possibilità di effettuare il risanamento fitosanitario da virus, viroidi e batteri osi, attraverso la tecnica della termo e crio-terapia. Inoltre, attraverso la conservazione a basse temperature (tra 0 e 5°C) e la crioconservazione in azoto liquido, è possibile stoccare piccole porzioni di materiale vegetale (cellule, tessuti, plantule) per periodi di tempo prolungati (da alcuni mesi fino a diversi anni).

Il protocollo adottato per il trasferimento in vitro del germoplasma prevede le seguenti fasi, che sono state adattate a seconda della tipologia del materiale (specie, condizioni vegetative) e del periodo di esecuzione dell’operazion:

  • isolamento delle gemme (dormienti o in fase di sviluppo; apicali e/o ascellari)
  • pre-lavaggio in acqua e Tween 20© per alcuni minuti;
  • immersione in alcool etilico al 75-95% per alcuni secondi;
  • immersione in NaOCl (concentrazioni dall’1 al 4%) per alcuni minuti;
  • risciacquo in acqua sterile e bagno in soluzione acquosa contenente Poli-Vinil-Pirrolidone (PVP) (1g/l);
  • lavorazione sotto cappa a flusso laminare (deperulazione, ripulitura, prelievo del meristema) e trasferimento in vasi contenenti un substrato agarizzato specifico (terreno Murashige&Skoog (1962), con sali dimezzati e l’aggiunta di 1 g/l di PVP) e successiva collocazione in cella climatica (23±1°C, fotoperiodo di 16 ore di luce).

Le sterilizzazioni sono state ripetute in diversi momenti che, in base allo stato fisiologico delle gemme, si possono raggruppare in due periodi:

  • tardo inverno, mediante gemma dormiente con fabbisogno in freddo raggiunto, tramite prelievo di apice meristematico allo stereomicroscopio;
  • primavera-estate con gemme in piena fase di sviluppo vegetativo, tramite semplice prelievo della gemma apicale e/o ascellare da germogli non lignificati.

Nell’ambito della coltura in vitro la fase di sterilizzazione resta tra le più delicate e difficili, non tanto in termini di esecuzione quanto in termini di successo finale.

Generalmente, infatti, solo un piccolo numero di gemme supera indenne questo momento. Il problema principale è dato infatti dalla carica di spore e cellule di microrganismi come funghi, lieviti e batteri che normalmente ricopre l’epitelio dei tessuti vegetali e che nelle condizioni di crescita controllata, tipico della micropropagazione, trovano un terreno fertile dove propagarsi finendo con l’avere il sopravvento sugli espianti vegetali. L’obiettivo di questa fase è quello di riuscire ad eliminare questa carica contaminante senza compromettere la vitalità delle gemme o dei tessuti meristematici che si vuole trasferire in vitro. La difficoltà consiste proprio nel trovare il giusto equilibrio tra la concentrazione dell’agente sterilizzante, la durata del trattamento e le condizioni del materiale di propagazione utilizzato, allo scopo di allestire colture asettiche.

Nella pratica tuttavia i problemi non terminano con la sterilizzazione. Gli espianti che superano questa fase devono infatti raggiungere la piena stabilizzazione, fase al termine della quale hanno acquisito la capacità di crescere e moltiplicarsi in un ambiente completamente artificiale come quello dato dalle condizioni della coltura in vitro. Non è scontato, pertanto, che una gemma risultata sterile e vitale riesca poi ad adattarsi alle condizioni del vitro, ragione che implica la necessità di sterilizzare un numero sempre piuttosto elevato di espianti.

Il materiale che riesce a superare queste due fasi è poi trasferito su substrati nutritivi la cui formulazione è studiata per ottenere un accrescimento ottimale degli espianti ed è specifica per ogni genotipo. In questo modo i singoli germogli sono indotti a crescere aumentando di numero attraverso ripetuti cicli (subcolture) di proliferazione e garantendo la costituzione di adeguati stock di materiale. Questo permette, in un secondo momento, di utilizzare una parte del materiale per le diverse attività di studio e ricerca, quali la crescita in condizioni rallentate (Slow Growth Storage) e la produzione di piantine vitro-derivate.

 

CONSERVAZIONE ALLE BASSE TEMPERATURE (SLOW GROWTH STORAGE)

Questa particolare metodologia consiste nello stoccare a basse temperature (generalmente tra 0 e 5°C) il materiale in micropropagazione. In queste condizioni il metabolismo dei germogli rallenta sin quasi a fermarsi, dato che le cellule entrano in una fase di quiescenza più o meno totale: ciò permette di ritardare fino a molti mesi il tempo tra una subcoltura e la successiva, con ovvi vantaggi sia in termini di costi e di lavorazione, che in termini di riduzione del rischio di contaminazioni ed insorgenza di possibili mutazioni genetiche indotte dalla ripetuta proliferazione.

Nello specifico il protocollo adottato prevede lo stoccaggio del materiale micropropagato per tempi di 3, 6, 9 e 12 mesi in un armadio climatico (fitotrone) settato a 4,3±0,3°C e con fotoperiodo di 12 ore di luce. Al termine di ciascuno di questi periodi di frigoconservazione gli espianti sono trasferiti in cella climatica (a 23°C) per un normale ciclo di proliferazione, per poi essere nuovamente reinseriti in fitotrone per un nuovo periodo di frigoconservazione pari al precedente. Questo ciclo viene ripetuto fintantoché gli espianti si mostrano capaci non solo di resistere alle basse temperature ma anche di riprendere a svilupparsi una volta riportati alle normali condizioni di crescita. Il protocollo di frigoconservazione è stato messo a punto e testato nel corso degli anni su molte delle varietà presenti in collezione.

Banca dei semi

La Banca dei semi è stata costituita nel 2002 nell’ambito delle attività previste dal progetto “La Valorizzazione della Biodiversità vegetale in Umbria e la sua Conservazione” ed è ospitata presso strutture del dipartimento di Scienze Agrarie alimentati e Ambientali dell’Università degli Studi di Perugia a Sant’Andrea d’Agliano (PG). Qui i campioni di semi, provenienti dalle attività di ricerca sul territorio regionale, sono pro­cessati e collezionati secondo uno specifico protocollo che prevede: pulitura dei semi dalle impurità e successiva disi­dratazione fino al 5-6% di umidità. I singoli lotti di semi sono poi chiusi in sacchetti sottovuoto e quindi stoccati a -18°C, dove potranno essere conservati per molti anni.

Attualmente la banca dei semi raccoglie 205 accessioni così ripartite:

  • Leguminose da granella, 156
  • Ortive, 62
  • Cereali, 31
  • Foraggere, 8

Microbanca

microbanca

La Collezione regionale dei lieviti e dei batteri lattici autoctoni è stata realizzata nel corso del progetto “La Valorizzazione della Biodiversità vegetale in Umbria e la sua Conservazione”, a partire dal 2002. Da allora, l’Unità di Ricerca di Microbiologia del DSA3 dell’Università di Perugia ne cura la conservazione in apposite strutture dove i ceppi, raccolti presso aziende trasformatrici (Cantine, Salumifici, Ditte Casearie) della Regione Umbria, e successivamente isolati in laboratorio, sono stoccati in forma congelata alla temperatura di -80°C e in celle climatiche a 4°C in forma liofilizzata.

Oltre all’aspetto di ricerca e conservazione della biodiversità microbica, la Collezione è importante perché permette di mantenere ceppi di microorganismi che, in seguito a test tecnologici attuati in laboratorio, hanno dimostrato di possedere qualità tecnologiche uniche utilizzabili per migliorare i processi produttivi aziendali.

Attualmente la Collezione, ospitata presso l’Industrial Yeasts Collection DBVPG del DSA3, raccoglie 89 ceppi di lieviti isolati da cantine, 21 di lieviti e 19 di batteri lattici isolati da caseifici e salumifici.

Zoobanca

L’Unità di Ricerca di Scienze Zootecniche del DSA3 dell’Università di Perugia ha curato l’allestimento di una banca del genoma per la razza Chianina allevata in Umbria. La banca consiste in campioni di DNA prelevati da esemplari di entrambi i sessi e poi conservati a -80 C° in CRIO TUBI.
I campioni di DNA potranno essere utilizzati sia per la selezione genomica volta all’individuazione di alleli favorevoli per le produzioni sia per ogni altro tipo di screening genetico volto alla scoperta di geni utili o deleteri per il processo di miglioramento genetico. Tali informazioni potranno essere utilizzate per le scelte selettive, unitamente ai dati provenienti dai metodi tradizionali di selezione, di tipo quantitativo.

Campi collezione di specie arboree da frutto

È oramai noto da tempo che i migliori risultati nella conservazione delle risorse genetiche vegetali si ottengono attraverso una equilibrata diversificazione delle strategie e delle tecniche utilizzate, in modo tale che gli svantaggi dell’una possano essere compensati dai vantaggi dell’altra. È con questa consapevolezza che nel corso degli anni, relativamente alle specie arboree da frutto, si è lavorato per affiancare alla collezione in vitro anche una collezione in vivo, realizzando alcuni campi collezione. In questo modo non solo si è voluto ridurre ulteriormente il rischio di perdita del materiale ma, raccogliendo insieme gli esemplari altrimenti sparsi sull’intero territorio regionale, si è creata l’opportunità di poterli studiare e confrontare agevolmente tra loro.

L’obiettivo principale dei campi collezione realizzati resta infatti quello della conservazione, cui però segue quello di studio, attraverso il monitoraggio dei principali caratteri morfologici, fenologici e produttivi degli esemplari in collezione. Ad oggi sono stati realizzati tre campi collezione:

  • Casalina di Deruta (PG), su terreni della Fondazione per l’Istruzione Agraria;
  • Pantalla di Todi (PG), su terreni di pertinenza della 3A-PTA.
  • Lugnano in Teverina (TR), su trreni della Comunanza Agraria

I primi due raccolgono varietà locali e germoplasma di specie arboree da frutto recuperate sul territorio regionale a partire dal 2002. Il terzo sito, invece, raccoglie parte della Collezione mondiale di Olivi a suo tempo costituita dal CNR-ISAFoM.

Annualmente su questi campi sono eseguiti i lavori necessari di mantenimento delle piante in vivo: sfalcio del prato, potature invernali ed estive, concimazioni con sostanza organica, fissaggio a pali tutori, controllo delle popolazioni dei principali fitofagi mediante trappole a feromone e trattamenti fitosanitari a base di prodotti rameici per il controllo delle crittogame

Campo collezione di Casalina

campo-collezione-di-casalina

Il frutteto didattico dimostrativo è stato realizzato nel 2003 nell’ambito del progetto La Valorizzazione della Biodiversità vegetale in Umbria e la sua conservazione” e si trova a Casalina di Deruta (PG), su terreni della Fondazione per l’Istruzione Agraria, incaricata di effettuare le operazioni di gestione agronomica. Occupa una superficie di circa 6500 m2, ed ospita una collezione di varietà locali di Susino, Melo, Pero, come di seguito indicato, oltre ad alcune cultivar commerciali di confronto, in numero di 3 repliche per varietà.

  • Melo, 18
  • Pero, 16
  • Susino, 7

Campo collezione di Pantalla

Il primo nucleo è stato costituito nel 2006 accogliendo 20 accessioni tra Melo, Pero e Susino. Da allora è stato annualmente ampliato fino ad includere 130 accessioni, che oggi comprendono anche varietà di Ciliegio, Mandorlo, Fico, Albicocco, Cotogno e Vite. La collezione, che si estende su una superficie di circa 4000m2, si trova presso terreni di pertinenza di 3A-PTA a Pantalla di Todi (PG), che si occupa anche della sua gestione agronomica. Di seguito è riportata la ripartizione delle accessioni per specie (ogni varietà è presente con almeno due repliche).

  • Melo, 45
  • Pero, 27
  • Susino, 15
  • Ciliegio dolce, 12
  • Vite, 10
  • Fico, 7
  • Pesco, 5
  • Ciliegio acido, 3
  • Albicocco, 2
  • Cotogno, 2
  • Mandorlo, 2

Campo collezione di Lugnano in Teverina

Il Campo Collezione di Lugnano in Teverina, situato in località Felceti, comprende oltre 300 accessioni di olivo (Olea europaea L., sottospecie europaea, var. europaea), rappresentate da varietà provenienti dai paesi olivicoli del Mediterraneo, del Medio Oriente e delle nuove aree di coltivazione.

Le varietà derivano da una più vasta collezione di germoplasma raccolta e conservata a cura del Consiglio Nazionale delle Ricerche – Istituto per i Sistemi Agricoli e Forestali del Mediterraneo (CNR-ISAFOM) di Perugia. Il CNR – Istituto di Bioscienze e Biorisorse (CNR-IBBR) di Perugia ha contribuito alla loro caratterizzazione (genetica, morfologica e bio-agronomica). Le marze utilizzate per gli innesti provengono dalla collezione della Provincia Regionale di Enna, a Pergusa (EN), dove le principali varietà della collezione CNR sono replicate in campo dal 2004.

Questa collezione, oltre alla conservazione del germoplasma, è destinata alla sua valutazione biologica ed agronomica e come fonte di variabilità per il miglioramento genetico. Essa rappresenta un primo nucleo di raccolta, che sarà arricchito nei prossimi anni con altre varietà, specie e sottospecie affini all’olivo.

Campo collezione della Scuola Agraria ʺCiuffelliʺ di Todi

Dal 2014, l’Istituto Agrario «Ciuffelli» ospita presso i terreni adiacenti il complesso scolastico una piccola collezione di varietà di olivo e di vite. Le varietà di olivo provengono dalla duplicazione della Collezione di germoplasma del CNR ISAFOM di Perugia. Le varietà di olivo qui presenti sono solamente quelle di origine umbra.
Le varietà di vite collezionate provengono da una specifica attività di ricerca condotta dall’Istituto nell’ambito del territorio della Media Valle del Tevere. Le collezioni fanno parte integrante dell’offerta didattica della scuola e, nel caso specifico della vite, potranno essere studiate nell’ottica di un loro recupero e valorizzazione in termini enologici, grazie alla cantina sperimentale della Scuola.

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